В настоящее время большинство специалистов в области репродуктивной медицины признаёт существование несомненной корреляции между мужским бесплодием и инфекционно-воспалительными процессами на территории органов половой системы. При этом одним из наиболее часто обнаруживаемых патогенов в клетках и тканях органов репродукции являются возбудители урогенитальной хламидийной инфекции (УГИ) [1]. Вместе с тем, многие патогенетические механизмы нарушений фертильных характеристик семенной жидкости, индуцированных урогенитальными штаммами хламидий, остаются малоизученными. В частности, несмотря на исключительное значение, которое придается нормальной морфологии сперматозоидов для успешности оплодотворения in vivo и in vitro [2], роль хламидий в развитии тератозооспермии практически не исследована. Учитывая, что указанные облигатные внутриклеточные паразитические микроорганизмы обладают способностью изменять нормальную структуру эукариотических клеток, цель настоящей работы состояла в выяснении возможных механизмов образования атипичных форм спермиев и оценке причастности к ним возбудителей УГИ при мужских инфертильных состояниях.
Для изучения патогенеза тератозооспермии нами был обследован эякулят 206 пациентов с УГИ в возрасте от 22 до 58 лет, обратившихся в лечебно-диагностический центр ТОО «Казсервиссбыт» по поводу бесплодия в браке продолжительностью более 12 месяцев. При изучении качественных и количественных характеристик семенной жидкости руководствовались требованиями по сбору материала, критериями и стандартами, рекомендуемыми ВОЗ [2]. Дополнительное цитоморфологическое исследование производили на мазках семенной жидкости, окрашенных азур-II – эозином. Принимая во внимание общеизвестный факт, что для урогенитальных штаммов хламидий характерно накопление во включениях гликогена, часть мазков после гликоген-сберегающей фиксации по Жандру окрашивали ШИК-реакцией по Мак-Манусу с докраской ядер гематоксилином Гарриса. На отдельных мазках эякулята ставили реакцию прямой иммунофлуоресценции (ПИФ) для выявления присутствия антигенов Chl. trachomatis. При этом использовали стандартные диагностические наборы, произведенные в НПФ «Галарт-диагностикум» и «Лабдиагностика» (Москва). Образцы семенной жидкости для электронномикроскопического исследования фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида с постфиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия, проводили по общепринятой методике и заключали в эпон. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим – азуром-II и основным фуксином по C. Humphrey, F.A. Pittman (1974). Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу. Срезы изучали в электронном микроскопе ЭВМ–100Л.
В изученном нами материале была обнаружена тератозооспермия в большинстве образцов семенной жидкости. Как следует из данных литературы, допустимый уровень относительного содержания тератоформ сперматозоидов в эякуляте к настоящему времени окончательно не установлен и имеет значительный разброс – 70-85% [2,3]. Таким образом, констатация тератозооспермии, во многом зависит от подхода исследователя, выбирающего то или иное условное пограничное значение. В наших исследованиях, при использовании в качестве пограничного критерия 70% тератоформ, тератозооспермия имела место у 202 человек (98,06%). Принимая за условную границу нормы максимально допустимое содержание патологических форм гамет (85%), как это рекомендуется при проведении вспомогательных репродуктивных технологий, тем не менее, тератозооспермия была нами выявлена у большинства инфертильных пациентов с УГИ – 146 (70,87%). При этом у абсолютного большинства больных имела место астенозооспермия – 194 пациента (94,18%), а у 31 больного (15,05%) была обнаружена олигозооспермия менее 20×106/мл. Следует заметить, что у каждого обследованного инфертильного пациента с УГИ мы обнаруживали практически неограниченное разнообразие проявлений цитоатипии гамет, причём, множество аномальных половых клеток имело сочетание сразу нескольких структурных дефектов. Выявленные нарушения морфологии сперматозоидов нами были рассмотрены с позиции основных категорий, которые предлагается различать в соответствии с рекомендациями ВОЗ [2] и приведены ниже с краткими комментариями.
а) дефекты головок гамет нами были обнаружены во всех образцах семенной жидкости, даже включая материал тех пациентов, у которых содержание тератоформ не превышало 70%-ного критического значения (рис. 1A-D). Аномалии размера головок были представлены различными вариантами от безъядерных, часто подвижных, жгутиков (спермии с «булавочной» головкой), до спермиев с микро- и макроформами головок, при которых последние могли быть увеличены в 2-4 раза и более. Многие тератоформы сперматозоидов имели шаровидную, коническую, грушевидную, булавовидную, аморфную или иную атипичную форму головки. Нередкой находкой были и сперматозоиды с множественными головками. Часто головки дефектных половых клеток были вакуолизированы или сочетали в себе отклонения размера и формы одновременно. При этом во многих головках аномальных спермиев наблюдали изменения размера, структуры и локализации акросомы, включая отсутствие последней на головках сперматозоидов.
Комментируя рассматриваемую категорию атипии клеток эякулята, представляется очевидным, что изменение морфологии головки сперматозоида, практически лишённой цитоплазмы, обусловлено, прежде всего, вариациями размеров и формы клеточного ядра. При этом следует заметить, что сперматозоид не способен к синтезу или катаболизму нуклеопротеидов и имеет в ядре чрезвычайно плотно упакованную ДНК, неактивную в транскрипции [4]. Соответственно, отклонения в размере и форме ядра у тератоформ сперматозоидов может быть связано с изменением количества, либо дефектом укладки генетического материала в течение спермиогенеза. Крайним вариантом является полное отсутствие ядра у атипичной половой клетки (спермий с «булавочной» головкой, рис. 1A, B). Наиболее вероятным механизмом возникновения таких элементов, учитывая их частую жизнеспособность и подвижность, являются локальные нарушения спермиации, при которых жгутик с фрагментом резидуальной цитоплазмы высвобождается в просвет извитого канальца отдельно от ядра. В свою очередь, сперматозоиды с микро- и макроформами головок возникают в результате отклонений в распределении генетического материала между дочерними клетками в ходе мейотических делений сперматогенеза. Вряд ли в семявыводящих путях может существовать какой-либо фактор, избирательно меняющий содержание хроматина в ядрах сперматозоидов, и, тем более, «формирующий» у спермия дополнительные головки. Рассматривая механизм, каким образом возникают вышеперечисленные нарушения формы головки гамет, важно помнить, что ядро половой клетки из шарообразного (у круглой сперматиды) в уплощённый, практически правильный, эллипсоид (у сперматозоида) преобразуется в течение спермиогенеза под влиянием манжетки и, сопровождающих её, многих сотен цитоплазматических микротрубочек, окутывающих ядро. Микротрубочковый аппарат не только способствует «выдавливанию» кариоплазмы и элиминации рибонуклеопротеидов, но и поддерживает форму ядра до завершения специфической укладки хроматина, т.е., до тех пор, пока ядро не станет способно самостоятельно поддерживать видоспецифичную форму. Параллельно происходит сверхкомпактная укладка ДНК с заменой нуклеогистонов на химически инертные протаминоподобные белки. Блокировка или локальное нарушение различных фаз указанного процесса ведёт к тому, что головка гаметы остаётся шарообразной или приобретает аномальную форму [5]. Изменение размера акросомы или её локализации на головке сперматозоида также объясняются, прежде всего, дефектами формирования гаметы в СПЭ. Патогенный фактор может повредить или разрушить акросому, но не в состоянии уменьшить или переместить указанную фиксированную органеллу в пределах зрелого сперматозоида.
Рис. 1. Атипичные формы мужских половых клеток в эякуляте инфертильных пациентов с УГИ. A – тератозооспермия в образце семенной жидкости бесплодного пациента; парциальная глобозооспермия (множество спермиев имеет круглую головку). B – спермии с «булавочной» головкой (стрелки); «склонённая шейка» у сперматозоида с «булавочной» головкой (двойная стрелка). C, D – множественные сочетанные дефекты половых клеток; стрелками обозначены азурофильные включения в избыточной капле резидуальной цитоплазмы. A, B – гемоцитометр, фазовый контраст, увеличение ×400. C, D – азур-II – эозин, увеличение ×1000.
б) дефекты шейки и средней части гамет также нами были обнаружены во всех исследуемых образцах эякулята. Они включали спермии со «склонённой шейкой» (сперматозоиды с гетероаксиальностью), асимметричным прикреплением средней части к головке, утолщённой, неравномерной или патологически тонкой средней частью и т.д.
Рассматривая механизм возникновения перечисленных дефектов, следует подчеркнуть, что сперматозоид представляет собой жёстко-упругую биологическую конструкцию, позволяющую выдерживать значительные механические нагрузки, напряжения и деформации. Соответственно, феномен «склонённой шейки» сперматозоида (рис. 1, A, B, C), а также асимметричного прикрепления средней части к головке, тесно связан с аномалиями формирования центра организации микротрубочек (ЦОМТ) – базального тельца и, связанных с ним, микротрубочек аксонемы во время сперматогенеза. Мы полагаем, что действие повреждающего фактора на нормальный зрелый сперматозоид, скорее, может привести к его разрушению, чем к возникновению стойкой деформации по типу «излома» жёстких тубулиновых структур жгутика. Между тем, спермии со «склонённой шейкой» весьма часто жизнеспособны и активноподвижны, что указывает на отсутствие влияния значимых повреждающих посттестикулярных факторов. Следует заметить, что развитие дефекта по типу «склонённой шейки» может происходить без обязательного участия ядра спермия, что подтверждает рис. 1, B (двойная стрелка). На данной микрофотографии нами приведено изображение сперматозоида с «булавочной» головкой (без ядра), но имеющего, тем не менее, «склонённую шейку». Количество и распределение митохондрий в средней части половой клетки также может изменяться только на уровне сперматогенного пласта. По крайней мере, в доступной нам литературе мы нигде не обнаружили свидетельств возможности деления и перемещения митохондрий в зрелых сперматозоидах человека. Здесь следует отметить, что для перемещения органелл эукариотическая клетка использует элементы цитоскелета, и, в частности, систему цитоплазматических микротрубочек, которых лишён зрелый сперматозоид [5].
в) дефекты хвоста, включая укороченные или множественные жгутики, хвосты в виде шпильки, сломанные, наклонные (угол больше 90º) закрученные, неравномерной толщины и их комбинации, были обнаружены нами во всех образцах семенной жидкости инфертильных пациентов.
Важно подчеркнуть, что в отличие от «лабильных» микротрубочек гиалоплазмы, тубулиновые структуры жгутиков и ресничек являются стабильными элементами, которые демонтировать или реконструировать дифференцированная клетка не в состоянии [6,7]. При этом многие сперматозоиды с дефектами жгутика являются живыми и даже могут сохранять частичную подвижность. С нашей точки зрения, трудно представить себе посттестикулярное действие какого-либо повреждающего фактора, вызывающего деполимеризацию, перераспределение и последующую аномальную сборку тубулиновых структур аксонемы, ведущих к стойкой деформации жгутика, при которых клетка может оставаться подвижной и жизнеспособной. Ещё труднее вообразить механизм, с помощью которого половая клетка в семявыводящих путях могла бы «сконструировать» себе дополнительный жгутик. Таким образом, феномен атипичных или множественных жгутиков, равно как и дополнительных головок, у тератоформ гамет объясняется аномальным развитием синцитиев половых клеток в СПЭ и нарушением взаимоотношений последних с сустентоцитами во время спермиации.
г) наличие цитоплазматической капли, занимающей более ½ пространства головки нормального сперматозоида, также было нами обнаружено у значительной части гамет во всех исследуемых образцах семенной жидкости бесплодных больных с УГИ (рис. 2A-D).
Заметим, что действие любого повреждающего фактора на спермий, находящийся в семявыводящих путях, не может приводить к значительному увеличению объемов резидуальной цитоплазмы половой клетки без повышения проницаемости цитолеммы, мало совместимого с жизнедеятельностью. Тем не менее, многие сперматозоиды с избыточной каплей резидуальной цитоплазмы – это живые и, часто, активно подвижные клетки. Важно подчеркнуть, что освобождение половой клетки от бόльшей части остаточной цитоплазмы происходит с участием тубуло-бульбарных комплексов сустентоцитов в процессе спермиации и освобождения сперматозоида из синцития в СПЭ. Лишь небольшие фрагменты резидуальной цитоплазмы спермий может удалять самостоятельно в процессе созревания в придатке семенника [5]. При тератозооспермии, индуцированной возбудителями УГИ, сперматозоиды с избыточной цитоплазматической каплей имеют особое значение, поскольку именно на территории резидуальной цитоплазмы могут быть обнаружены включения патогена (рис. 1C-D, 2A-D).
Рис. 2. Микроколонии-включения возбудителя УГИ в избыточной капле резидуальной цитоплазмы атипичных половых клеток пациентов со сниженной фертильностью (стрелки). A, B – азур-II – эозин; C – ШИК-реакция по Мак-Манусу с докраской ядер гематоксилином Гарриса после гликоген-сберегающей фиксации по Жандру; стрелками обозначены включения гликогена; D – реакция прямой иммунофлуоресценции по выявлению антигенов Chl. trachomatis. Увеличение ×1000.
Ультраструктурное исследование подтверждает возможность обнаружения в семенной жидкости инфицированных пациентов как внеклеточных элементарных телец патогена, так и различных фаз внутриклеточного развития возбудителей УГИ на территории резидуальной цитоплазмы атипичных половых клеток эякулята (рис. 3A-D). При этом аномальные половые клетки не только обнаруживают очевидную патологию формирования во время спермиогенеза, но и, часто, демонстрируют признаки приближающейся клеточной гибели, что позволяет рассматривать высокую вероятность связи присутствия инфекционного агента с клеточной цитоатипией. Следует подчеркнуть, что после отделения от сперматогенного пласта трофическое обеспечение любой половой клетки существенно редуцируется. В свою очередь, снижение метаболического обеспечения десквамированной атипичной гаметы не может не сказаться на внутриклеточном цикле развития патогена. В этой связи важно обратить внимание на то, что в структурах возбудителя, находящегося на разных стадиях развития (ретикулярные, промежуточные и созревшие элементарные тельца), также могут быть обнаружены различные отклонения от типичного строения. При этом элементы патогена могут располагаться как внутри вакуолей, так и свободно в гиалоплазме тератоформ гамет, что характерно именно для погибающих клеток [8]. Также представляется интересным, что в условиях недостаточного трофического обеспечения жизненный цикл хламидий может претерпевать существенные изменения, приводя к появлению в резидуальной цитоплазме аномальных половых клеток чрезвычайно мелких форм возбудителя, что можно расценить как адаптационную модификацию, ведущую, в частности, к формированию персистентных форм микроорганизма.
Рис. 3. Ультраструктура атипичных половых клеток семенной жидкости инфертильных пациентов при УГИ. A – обилие интравакуолярных и свободно лежащих в гиалоплазме телец возбудителя на различных стадиях цикла внутриклеточного развития. Обращают на себя внимание полиморфность и различный размер структур патогена, свидетельствующие об асинхронности развития микроколоний даже в пределах одной клетки. Многие ретикулярные тельца дистрофически изменены. Стрелка – внеклеточное расположение зрелого элементарного тельца. B – увеличенный фрагмент участка резидуальной цитоплазмы атипичной половой клетки эякулята, изображенной на рис. 3,A. Полиморфные тельца возбудителя, свободно лежащие в гиалоплазме, включая мелкие персистентные формы. C – выраженная атипия половой клетки семенной жидкости при УГИ. Состояние, близкое к лизису клетки. Нарушенная конденсация хроматина в ядре; в резидуальной цитоплазматической капле – отсутствие структур аксонемы, свободнолежащие, дистрофически изменённые митохондрии (нижняя правая часть рисунка). Стрелка – свободно лежащие в гиалоплазме тельца возбудителя. Двойная стрелка – интравакуолярное расположение патогена. D – увеличенный фрагмент участка резидуальной цитоплазмы атипичной половой клетки эякулята, изображенной на рис. 3,C. ЭМ, Увеличение ×14000.
Обсуждая полученные результаты, следует особо подчеркнуть, что мы далеки от мысли о том, что любая обнаруженная атипичная половая клетка в эякуляте может быть объяснена именно присутствием УГИ, тем более, что урогенитальный хламидиоз в «чистом» виде в клинике практически не существует [9]. Следовательно, у любого конкретного пациента с бесплодием может иметь место сочетание множества патологических факторов, обуславливающих тератозооспермию. Тем не менее, важно учесть, что морфология зрелого сперматозоида является результатом реализации чрезвычайно жёсткой видоспецифичной генетической программы, в которую вряд ли укладывается производство практически бесконечного разнообразия тератоформ гамет. При этом нормальный сперматозоид человека, относящийся к спермиям модифицированного типа, является высокоспециализированной терминально дифференцированной гаплоидной клеткой, резистентной к действию разнообразных экзогенных повреждающих факторов. Это обусловлено биологической необходимостью длительного выживания и сохранения фертильных потенций гаметы в условиях агрессивной и, как правило, нестерильной внешней среды (около недели созревания в семявыводящих путях и от часов до нескольких суток пребывания в женском репродуктивном тракте [1]). Вне всякого сомнения, устойчивость спермия к внешним патогенным влияниям имеет свои пределы, за которыми происходит повреждение, гибель и разрушение сперматозоидов. Соответственно, чрезмерное действие любого патогенного фактора на уже сформированный спермий ведёт к альтерации и даже лизису клеточных структур, но не может приводить к глубокой структурной реорганизации и перестройке метаболически малоактивной гаметы. Между тем, для большинства атипичных форм спермиев при тератозооспермии характерны именно такие морфологические изменения, которые обусловлены нарушениями сперматогенеза, но не могут возникнуть в результате действия повреждающих факторов на зрелый сперматозоид.
Таким образом, представляется очевидным, что закономерный ряд генетически обусловленных, взаимосвязанных и хронологически детерминированных событий, лежащих в основе формирования структур сперматозоида, реализуется в извитых семенных канальцах семенника. Следовательно, большинство аномалий структуры половых клеток, которые рекомендуется идентифицировать при тератозооспермии, также может возникать только в результате отклонений в развитии гамет на уровне сперматогенного пласта. Тератозооспермия, индуцированная восходящим инфицированием СПЭ возбудителями УГИ, как частный случай тератозооспермии вообще, свидетельствует о вмешательстве патогена непосредственно в интимные процессы сперматогенеза и спермиогенеза. Морфофункциональное повреждение развивающихся синцитиев половых клеток, инфицированных хламидиями, может объясняться целым рядом взаимно потенцирующих факторов. Во-первых, внутриклеточное развитие патогена «оттягивает» на себя значительную часть клеточных ресурсов, включая макроэргические соединения [10]. Во-вторых, может иметь место повреждение элементов синцития токсичными продуктами метаболизма хламидий, включая эндо- и экзотоксины [11]. Кроме того, изменённая морфология спермиев однозначно указывает на угнетение функций сустентоцитов, в том числе, механизмов, обеспечивающих спермиацию. Установлено, что патогенные факторы хламидий вызывают нарушение функционирования элементов цитоскелета [12]. Соответственно, нарушение формирования и функционирования тубулинового аппарата (включая элементы ахроматинового веретена деления) может объяснить значительную часть аномалий головок и жгутиков сперматозоидов. Поскольку цитоатипия половых клеток, индуцируемая хламидиями, развивается в условиях чрезвычайно жёсткой пространственно-временной организации цикла СПЭ, следует предположить, что даже при адекватной этиотропной и патогенетической терапии уровень тератозооспермии будет снижаться очень медленно и постепенно, принимая во внимание продолжительность сперматогенеза и изолированность половых клеток структурами гематотестикулярного барьера.
Тератозооспермия при инфертильных состояниях, ассоциированных с УГИ, в значительной мере, обусловлена отклонениями сперматогенеза на уровне СПЭ, связанными с внутриклеточным развитием патогена в незрелых половых клетках, что подтверждается цитоморфологическим, иммуноморфологическим и ультраструктурным исследованием клеточных элементов семенной жидкости.