Определение морфофункциональной зрелости мужских гамет является необходимой составляющей общей оценки фертильного потенциала семенной жидкости при установлении причин мужского бесплодия [1]. Показано, что значительное увеличение относительного и абсолютного содержания незрелых половых клеток в эякуляте может служить существенным препятствием успешности оплодотворения как in vivo, так и при использовании вспомогательных репродуктивных технологий in vitro [2]. С другой стороны, представляется общеизвестным, что одной из наиболее распространённых причин мужского бесплодия является воспалительный процесс на территории органов мужской репродуктивной системы, в том числе, индуцированный восходящей урогенитальной хламидийной инфекцией (УГИ) [3]. У инфертильных пациентов с урогенитальным хламидиозом многие исследователи обнаруживают различные отклонения показателей спермограммы, включающие изменение концентрации сперматозоидов, снижение их подвижности и жизнеспособности, различные уровни тератозооспермии на фоне признаков нейтрофильно-мононуклеарной воспалительной реакции [4]. При этом незрелым клеткам эякулята (в силу функциональной неполноценности, заведомо не способным принять участие в оплодотворении) уделяется существенно меньшее внимание. С нашей точки зрения, подобный подход является совершенно неоправданным, поскольку повышенное содержание различных типов незрелых половых клеток в семенной жидкости является отражением нарушений механизмов сперматогенеза и посттестикулярного созревания гамет, и, следовательно, несомненно, вносит свою лепту в снижение мужской фертильности. Принимая во внимание способность хламидий инфицировать ткани семенника, облигатный внутриклеточный характер паразитирования патогена, а также угнетающее действие возбудителя на метаболизм клетки-хозяина [5], можно предположить возможность искажения или блокирования отдельных механизмов дифференцировки сперматозоидов, ведущую к повышенному содержанию в эякуляте незрелых элементов сперматогенного эпителия (СПЭ) в условиях УГИ. Соответственно, цель нашего исследования состояла как в изучении самого феномена незрелых половых клеток семенной жидкости, так и выяснении возможной причастности хламидийной инфекции к повышению концентрации указанных элементов в эякуляте, способствующему снижению мужской фертильности.
Для изучения содержания и морфофункциональной характеристики незрелых половых клеток нами был исследован эякулят 206 пациентов с УГИ в возрасте от 22 до 58 лет, обратившихся в лечебно-диагностический центр ТОО «Казсервиссбыт» по поводу бесплодия в браке продолжительностью более 12 месяцев. В соответствии с целью работы пациенты с азооспермией в настоящее исследование не были включены. Качественные и количественные показатели семенной жидкости оценивали на основе требований по сбору материала, критериев и стандартов, рекомендуемых ВОЗ [1]. Цитоморфологическое исследование производили по мазкам семенной жидкости, окрашенным азур-II – эозином. На дополнительных мазках эякулята ставили реакцию прямой иммунофлуоресценции (ПИФ) для выявления присутствия антигенов Chl. trachomatis. При постановке ПИФ использовали стандартные диагностические наборы, произведенные в НПФ «Галарт-диагностикум» и «Лабдиагностика» (Москва). Образцы семенной жидкости для электронномикроскопического исследования фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида с постфиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия, проводили по общепринятой методике и заключали в эпон. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим – азуром-II и основным фуксином по C. Humphrey, F.A. Pittman (1974). Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу. Срезы изучали в электронный микроскоп «Libra-120» (Carl Zeiss, Германия).
Тщательное изучение материала бесплодных пациентов с УГИ позволило нам выявить значительные отклонения в показателях спермограммы у подавляющего большинства обследованных. Так, у 31 пациента (15,05%) была обнаружена олигозооспермия (<20×106/мл); у 32 больных (15,53%) имела место, напротив, полизооспермия (>200×106/мл). Снижение концентрации подвижных сперматозоидов (<50%) по категориям (a + b) было установлено у 194 пациентов (94,18%); тератозооспермия (>70%) была выявлена у 202 мужчин (98,06%). Уменьшение концентрации живых спермиев (<50%) было обнаружено у 29 человек (14,08%). Наличие признаков нейтрофильно-мононуклеарной либо мононуклеарной воспалительной реакции было идентифицировано у 204 пациентов (99,03%). При этом усреднённое значение концентрации лейкоцитов в семенной жидкости в группе обследованных больных составило (4,58±0,12)×106/мл при норме 1,0×106/мл. Среднее значение десквамированных незрелых половых клеток у пациентов группы составило 16,18±0,68%, причём у 48 больных (23,3%) концентрация незрелых клеток сперматогенеза в эякуляте была более 20%.
Необходимо сразу отметить, что рассмотренное 20%-ное пороговое значение содержания незрелых половых клеток в семенной жидкости мы не считаем достаточно адекватным показателем. Это связано с сомнениями в справедливости подхода к качественной и количественной оценке зрелости половых клеток эякулята, предлагаемого в «Руководстве ВОЗ…» [1], что будет обсуждено ниже. Поскольку некоторое количество незрелых клеток сперматогенеза обнаруживается в семенной жидкости всегда (даже у здоровых фертильных обследуемых), мы полагаем, что уточнение показателя допустимой концентрации данных клеточных элементов может иметь немаловажное значение для диагностики мужского бесплодия.
Рис. 1. Незрелые половые клетки семенной жидкости инфертильных пациентов с УГИ. A – большинство десквамированных незрелых половых клеток относится к сперматидам, имеет отчётливые признаки элонгации и не соответствует понятию «круглая клетка». B – сперматоцит с азурофильными цитоплазматическими включениями. C, D – круглые и элонгированные сперматиды с цитоплазматическими азурофильными включениями. E, F – специфическое свечение в цитоплазме круглых и элонгированных сперматид – ПИФ-реакция по выявлению антигенов Chl. trachomatis (стрелки). A – гемоцитометр, фазовый контраст, увеличение ×400. B, C, D – азур-II – эозин. B – F – увеличение ×1000.
В исследованном нами материале инфертильных пациентов с УГИ незрелые половые клетки обнаруживались в большом количестве как при использовании фазовоконтрастной микроскопии в нативном материале, так и в мазках окрашенных азур-II – эозином (рис. 1, A-D). Однако, как это отчётливо видно на демонстрируемых рисунках, незрелые клетки сперматогенеза были представлены отнюдь не только «круглыми клетками», подсчётом которых рекомендуется ограничиться в вышеупомянутом руководстве. Напротив, наряду с отдельными клеточными элементами, имеющими морфологию круглых сперматид, и, реже, – сперматоцитов и сперматогоний, большинство незрелых половых клеток соответствовало морфологии сперматид элонгированных, которые никак не могут быть вписаны в понятие «круглых клеток» эякулята. Тем не менее, незрелость указанных элементов можно было установить по отсутствию правильной эллипсоидной конфигурации и выраженной базофилии ядра, связанной с менее плотной упаковкой хроматина, и, по всей видимости, неполной заменой нуклеогистонов на протаминоподобные белки. Кроме того, в качестве свидетельств незавершенной дифференцировки могли выступать отсутствие акросомы или уменьшение площади акросомной области, отсутствие полноценных элементов жгутика, а также наличие избыточной капли резидуальной цитоплазмы, которой лишён нормальный сперматозоид.
Важно подчеркнуть, что в цитоплазме многих клеточных элементов, несущих в себе морфологические признаки незрелости, можно было обнаружить полиморфные базофильные, азурофильные или метахроматические включения различного размера, обнаруживающие специфическое свечение при постановке ПИФ по выявлению антигенов Chl. trachomatis. (рис. 1, B-F).
Изучение подобных клеток семенной жидкости с помощью электронной микроскопии также позволило обнаружить множество ультраструктурных признаков, свидетельствующих о незавершённой или неполноценной дифференцировке многих половых клеток семенной жидкости, не имеющих никакого отношения к «круглым клеткам» (рис. 2). Представляется очевидным, что оценка зрелости любой половой клетки, или, напротив, незавершённости её дифференцировки, устанавливаемая с помощью электронной микроскопии, позволяет уловить множество тонких признаков, которые трудно или вовсе невозможно обнаружить с помощью светового микроскопа. В частности, к подобным признакам, в дополнение к уже вышеупомянутым, можно отнести наличие зернистого, недостаточно конденсированного хроматина в ядре [6], несоответствие размеров акросомы, характерным для зрелой гаметы, отсутствие отдельных элементов аксонемы или структурных компонентов всего жгутика, наличие свободных цитоплазматических микротрубочек, неупорядоченное распределение митохондрий в резидуальной цитоплазматической капле [3,7] и т.д.
В рамках данной работы нам представляется исключительно важным, что наряду с констатацией ультраструктурных морфологических признаков незавершённости или искажённости дифференцировки половых клеток, электронная микроскопия позволяет обнаружить в резидуальной цитоплазме некоторых из них микроколонии возбудителей УГИ (рис. 2, A,B).
Рис. 2. Ультраструктура незрелых половых клеток инфертильных пациентов с УГИ. A – элонгированная сперматида с нарушенной конденсацией незрелого, «зернистого» хроматина. На фоне отсутствия структурных компонентов жгутика в капле резидуальной цитоплазмы обнаруживаются полиморфные интравакуолярные и свободнолежащие в гиалоплазме включения микроколоний патогена. Состояние, близкое к лизису клетки. B – различные стадии развития возбудителя, включая элементарные, промежуточные и ретикулярные тельца, в резидуальной цитоплазматической капле незрелой половой клетки. В правом верхнем углу микрофотографии – фрагмент аксонемы, окружённой митохондриями. ЭМ, шкала – 1µм. Увеличение ×16000.
На наш взгляд, здесь важно подчеркнуть несколько существенных моментов. Во-первых, общеизвестная асинхронность внутриклеточного развития отдельных клонов патогена может приводить к тому, что на территории резидуальной цитоплазмы могут одновременно обнаруживаться морфологические элементы, соответствующие различным стадиям цикла развития возбудителя, включая ретикулярные, промежуточные и зрелые элементарные тельца, как это показано на рис. 2, B. Во-вторых, в состоянии, близком к лизису клетки-хозяина, часть телец возбудителя может располагаться не в вакуолях, а свободно в гиалоплазме незрелой половой клетки. В-третьих, как это отчётливо видно на обеих электронных микрофотографиях, значительная часть морфологических структур возбудителя также находится в состоянии дистрофии, гибели и разрушения. По нашему мнению, данный факт можно объяснить тем, что десквамированная незрелая половая клетка, лишённая трофической поддержки сустентоцитов сперматогенного пласта, не может реализовать метаболическое обеспечение развития патологического агента, адекватное полноценному завершению его внутриклеточного цикла развития. И, наконец, мы склонны полагать, что сама по себе незрелость десквамированной атипичной половой клетки может быть напрямую связана с нарушениями механизмов клеточной дифференцировки, индуцированными внутриклеточным развитием возбудителя.
Обсуждая полученные результаты, прежде всего нам представляется целесообразным определиться с самим понятием «незрелая половая клетка», без чего приведённые данные теряют существенную часть своей значимости и ценности. Указанный вопрос является не столь простым, как кажется на первый взгляд, несмотря на множество работ, рассматривающих светооптическую и ультраструктурную морфологию мужских половых клеток. Как мы уже отметили выше, мы считаем, что предлагаемый в «Руководстве ВОЗ…» [1] и ссылающихся на него публикациях, качественный и количественный подход в определении незрелых половых клеток семенной жидкости является малоинформативным и не соответствующим современным представлениям о сперматогенезе человека.
Так, во-первых, нам не совсем понятны причины, по которым в указанном первоисточнике все незрелые половые клетки, вне зависимости от уровня дифференцировки (сперматогонии, сперматоциты, сперматиды) «до кучи» включены в состав так называемых «круглых клеток» эякулята вместе с эпителиальными клетками и лейкоцитами. Соответственно, приводится верхний предел содержания всех вместе взятых указанных круглых клеток семенной жидкости – 5×106/мл. При этом допустимая концентрация самих незрелых половых клеток в эякуляте не указывается вообще. Поскольку в качестве предела содержания лейкоцитов предлагается значение 1×106/мл, можно лишь условно предположить, что ВОЗ рекомендует считать верхней границей нормы для круглых незрелых половых клеток значение 4×106/мл. (Необходимо принять во внимание, что слущенные базальные и парабазальные (шиповатые) клетки многослойных эпителиев, а также клетки цилиндрических эпителиев, способные приобретать в «свободном» десквамированном состоянии округлую форму, встречаются в нормальном эякуляте весьма редко.) Если учесть, что нижняя граница нормы содержания сперматозоидов, в соответствии с указанным руководством, составляет 20×106/мл, логично предположить, что для нормальной семенной жидкости допускается содержание одних только круглых незрелых половых клеток до 20% (4×106/мл)! Подобные нормативы концентрации слущенных сперматогоний, сперматоцитов и круглых сперматид (а именно эти типы клеток можно идентифицировать как «круглые» незрелые половые клетки) представляются нам неоправданно завышенными и, на наш взгляд, свидетельствуют о существенных нарушениях функционирования сперматогенного пласта.
Во-вторых, при подобном подходе совершенно не учитывается общеизвестный факт, что преобладающая часть незрелых половых клеток эякулята, как правило, относится именно к сперматидам. Это можно объяснить хотя бы тем, что количество сперматид в сперматогенном эпителии (СПЭ) в норме значительно превосходит число сперматогоний и сперматоцитов. В свою очередь, как мы уже попытались продемонстрировать на рис.1-2, многие сперматиды вообще не могут рассматриваться в качестве «круглых клеток», поскольку относятся к элонгированным клеточным элементам (рис. 3) и имеют соответствующее название.
Рис. 3. Ассоциации половых клеток различных уровней дифференцировки на шести стадиях сперматогенеза в яичке человека. Ad – тёмные сперматогонии A-типа; Ap – бледные сперматогонии А-типа; B – сперматогонии B-типа; Pl – сперматоциты прелептотены; L – сперматоциты лептотены; Z – сперматоциты зиготены; EP, MP, LP – сперматоциты ранней, средней и поздней пахитены; I, II – завершение первого деления мейоза, сперматоциты II порядка и второе деление мейоза; Sa1 – Sd2 – стадии созревания сперматид (по Э. Нишлагу, Г.М. Бере, 2005 [3], с изменениями). Рекомендуется обратить внимание на то, что большинство морфологических типов сперматид (над горизонтальной чертой) относится к элонгированным клеточным элементам (Sb2 – Sd2), и, соответственно, не может быть отнесено к так называемым «круглым клеткам».
Получается, что исследователь, ориентированный на подсчёт только круглых незрелых половых клеток, автоматически упускает из вида все стадии десквамированных удлинённых (элонгированных) сперматид, несомненно, также являющихся незрелыми клеточными элементами эякулята.
В-третьих, как показало тщательное изучение клеток семенной жидкости бесплодных пациентов с УГИ, многие половые клетки, в целом, даже близкие по морфологии к сперматозоидам, могут иметь как отдельные, изолированные, так и множественные морфологические признаки незрелости, определяемые и на светооптическом, и на ультраструктурном уровнях. Как мы уже отмечали выше, к таким признакам можно отнести нарушение эллипсоидной формы головки гаметы (например, спермий с шарообразной головкой), уменьшенную степень конденсации хроматина в ядре («незрелый хроматин»), отсутствие акросомы или уменьшение площади акросомной области головки, отсутствие жгутика или ультраструктурное нарушение строения компонентов хвоста, отклонения в упорядоченном расположении митохондрий, наличие избыточной капли резидуальной цитоплазмы и т.д.
Здесь следует заметить, что процесс образования мужских гамет (спермиогенез) можно рассматривать в качестве частного случая дифференцировки клеток, при котором имеет место постепенное медленное формирование специализированного клеточного фенотипа, обеспечивающего максимальную способность к реализации основной биологической функции спермиев – участию в процессе оплодотворения. Изменения морфологии гаплоидных клеток столь значительны, хронологически упорядочены и длительны, что достаточно легко могут быть идентифицированы не только на ультраструктурном, но даже на светооптическом уровне, являясь основой для современной классификации стадийности сперматогенеза человека (рис. 3). Соответственно, имея представление о морфологических преобразованиях сперматид в течение цикла СПЭ, исследователь всегда может достаточно точно установить не только сам факт незрелости гаплоидной половой клетки эякулята, но даже примерно оценить, какой стадии сперматогенеза соответствует обнаруженный блок дифференцировки.
В указанном аспекте наличие у сперматозоида одного или нескольких вышеперечисленных признаков незрелости позволяет предположить, что под действием возбудителя УГИ внутриклеточные процессы, обеспечивающие формирование гаметы, могут быть разобщены и частично десинхронизированы ещё на уровне сперматогенного пласта. Как следствие, некоторые из относительно автономных процессов преобразования формы ядра, развития акросомы или жгутика, в норме протекающих синхронно и параллельно, оказываются заторможенными, искажёнными или заблокированными, что микроскопически определяется как изолированные дефекты спермия. Подобные частичные, локальные нарушения внутриклеточных механизмов дифференцировки сперматозоидов, в некотором смысле, сближают понятие «незрелая половая клетка» с отдельными морфологическими проявлениями тератозооспермии, в чём мы не усматриваем никакого принципиального противоречия. Сам по себе термин «тератозооспермия» подразумевает лишь присутствие в семенной жидкости избыточного количества гамет, морфология которых значительно отклоняется от нормальной, но отнюдь не исключает наличия у тератоформ половых клеток признаков незрелости. Важным, на наш взгляд, является лишь то, что все вышеперечисленные нарушения морфологии сперматозоидов указывают на искажение нормальных механизмов созревания, дифференцировки половых клеток ещё на уровне СПЭ.
Далее, необходимо добавить, что даже гамета, соответствующая всем строгим морфологическим критериям нормы [8], не может считаться в морфофункциональном отношении полностью зрелой (т.е., готовой к самостоятельному участию в оплодотворении) ни при высвобождении в процессе спермиации из СПЭ, ни даже после обязательного длительного созревания в канальцах и протоке придатка семенника. Окончательная селекция и подготовка сперматозоидов к оплодотворению, по мнению большинства авторитетных исследователей происходит уже на территории женского репродуктивного тракта [3]. Таким образом, представляется достаточно очевидным, что формирование и созревание сперматозоидов является целостным, непрерывным и неделимым процессом, включающим в себя гаметогенез на уровне извитых семенных канальцев семенников и посттестикулярные структурно-функциональные преобразования мужских половых клеток. Из сказанного, с одной стороны, закономерно вытекает условность и расплывчатость устанавливаемых нами границ и критериев оценки зрелости половых клеток, что, по справедливому замечанию А.П. Милованова и С.В. Савельева [9], свойственно любой искусственной периодизации онтогенеза человека. С другой стороны, мы считаем достаточно вероятным, что внутриклеточное развитие возбудителя УГИ в клетках СПЭ может оказывать свое патологическое влияние на самых разных стадиях морфофункциональной дифференцировки гамет, блокируя внутриклеточные процессы, необходимые для формирования полноценных фертильных сперматозоидов, в инфицированных клеточных клонах.
В-четвертых, в семенной жидкости бесплодных пациентов с урогенитальной хламидийной инфекцией мы постоянно обнаруживали морфологические элементы, которые, по нашему убеждению, также имеют непосредственное отношение к незрелым элементам сперматогенеза, хотя их вообще трудно назвать клетками в истинном значении этого слова. Речь идет о свободнолежащих ядрах круглых и элонгированных сперматид различных стадий дифференцировки, во множестве встречающихся в эякуляте инфертильных больных, и видимых, в частности, на рис. 1, A. Мы полагаем, что указанные свободнолежащие головки и ядра сперматид являются следствием массивного разрушения десквамированных незрелых половых клеток на территории семявыводящих путей. Поскольку хроматин сперматид более или менее насыщен химически и биологически инертными нуклеопротаминами, указанные ядра и головки сперматид могут сохраняться в семявыводящих путях достаточно долго даже после разрушения цитолеммы и структур гиалоплазмы. По нашему мнению, упомянутое разрушение незрелых половых клеток, отчасти, может быть закономерным следствием внутриклеточного развития возбудителей УГИ. Кроме того, мы уверены, что подобные элементы семенной жидкости обязательно должны учитываться при общем подсчёте концентрации незрелых клеток эякулята.
В-пятых, исследование эякулята бесплодных пациентов позволило нам обнаружить ещё один тип структурных элементов семенной жидкости, который, вне всяких сомнений, следует отнести к незрелым половым клеткам. Речь идёт о десквамированных из СПЭ многоядерных фрагментах клонов синцитиев развивающихся половых клеток. Указанные многоядерные структуры могут быть производными половых клеток самых разных этапов дифференцировки, хотя, чаще всего, образованы круглыми или элонгированными сперматидами. Многие из таких многоядерных образований также не могут рассматриваться в качестве «круглых клеток» семенной жидкости, что мы рассмотрим в одном из последующих сообщений.
Таким образом, изучение морфологии клеточных элементов семенной жидкости бесплодных пациентов с урогенитальным хламидиозом не только позволяет обнаружить присутствие структур возбудителя в резидуальной цитоплазме незрелых половых клеток, но и даёт основание предполагать существование связи между внутриклеточным развитием патогена и нарушениями процессов дифференцировки половых клеток в течение сперматогенеза, спермиогенеза и посттестикулярных морфофункциональных преобразований мужских гамет. Во многих случаях итогом влияния патогена на клетки сперматогенеза, развивающиеся в СПЭ, является их преждевременная десквамация с последующим частичным разрушением в семявыводящих путях. Кроме того, на основании полученных данных нам представляется совершенно очевидным, что само понятие «незрелая половая клетка» семенной жидкости должно быть расширено и включать не только «круглые клетки» эякулята, но и элонгированные сперматиды, гаметы с отдельными морфологическими признаками незрелости, свободно лежащие ядра незрелых половых клеток и многоядерные производные половых клеток. Соответственно, на наш взгляд, должны быть пересмотрены и уточнены пороговые нормы концентрации незрелых половых клеток эякулята в диагностике мужского бесплодия.